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细胞的裂解方法-细胞壁观察图像分析www.w88981.com,优德官方网站




来源:yiyi
时间:2017-7-3 18:59:24

细胞的裂解方法-细胞壁观察图像分析www.w88981.com,优德官方网站

   对于获得准确、有意义的分析数据而言,分离核酸的质量是至
关重要的为了从复杂的基质如细胞裂解液中获得高纯度的核酸,要
精心设计样品前处理过程。去除的典型杂质包括细胞碎片、小分子
、蛋白、细胞液、糖类、失活的细胞核酸酶和不需要的核酸。早年
人们曾经尝试将离心后的裂解液直接注射入色谱,但很快发现这样
会降低色谱柱的性能,造成背景干扰,增大柱后压等。此外,背景
中蛋白等物质不可逆的吸附,会改变色谱的选择性

    细胞裂解方法

    提取核酸的第一步是细胞裂解和核酸酶的灭活,二者可以同时
进行;例如,单一的提取液可以包括溶解细胞膜所用的表面活性剂
和灭活胞内酶所需的强离液盐:
    裂解的过程取决于细胞壁的性质,因此在研究中需要了解细胞
壁的组成和结构信息。例如,真菌主要有两种细胞壁,能够通过与
特定染料的反应而得到辨认,这种染料是Christian Gμm于19世纪
80年代发现的,被称为革兰氏染料,是一种结晶紫染料与碘的混合
物。当加入革兰氏染料时,革兰氏阳性细胞被染成紫色,而革兰氏
阴性细胞则变为红色。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚(30~100nm),
而革兰氏阴性菌的细胞壁较簿(20~30nm)。约40%~80%的革兰氏
阳性菌细胞壁是由·种坚硬而复杂的聚合物(肽聚糖)组成,见图8
.2,是由短肽所连接的线性杂多糖,具有很高的交联度。冈此,
革兰氏阳性菌的细胞壁(如化脓性链球菌)对于能水解肽链的青霉素
及其衍生物和溶菌酶(一种在IliON和唾液中发现的酶)十分敏感。
而革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)的细胞壁有一种显著的层状外观,如
图8.3所示,其内部由单层肽聚糖组成,外部则基本为含蛋白的脂
双层在革兰氏阴性菌中,15%~20%的细胞壁由断续交联的肽聚糖
组成,交联度决定了细胞壁的韧性。一般而言,革兰氏阳性菌比革
兰氏阴性菌更难裂解,新细胞比老细胞更难裂解,而小细胞比大细
胞更难以列解


细胞的裂解有多种方法,但是没有哪一种方法能用于所有的生物源
细胞。每一一种技术都有其优点和缺点,裂解方法的选择取决于细
胞的特点、种类以及后续的心用。在细胞裂解中,也可以同时使川
多种方法,如酶裂解法使用特定的酶作用于细胞壁,而可以破坏由
脂双层构成的细胞质膜,需要同时使用能够溶解脂质的表面活性剂
,选择一种裂解方法时,应既能有足够的破坏性达到裂解细胞的目
的,则致破坏目标核酸的完整性。当提取超声破碎法
    细胞超声破碎法是利用超声探针针尖的快速振动所产生的超声
波,即空化作用对细胞进行破碎的方法。空化会在针尖附近形成高
速的微小气泡流,气泡高速运动所产生的强剪切力将细胞破坏  这
并不是一个瞬时的过程,细胞悬液需要超声处理数分钟以使细胞裂
解至所需的程度。这种方法并不是初次细胞破碎时很好的选择,但
对于原生质球的破碎和革兰氏阴性菌细胞膜内外层的分离而言十分
有效。超声粉碎机在使用过程中通常会产生热量,冈此应该尽可能
地将样品置于冰浴中。在微生物裂解中,悬液中按1:2的比例加入
0.1~0.5mm直径的玻璃珠辅助超声破碎。超声过程中产生的自由
基可以与大多数生物分子反应,可以使用半胱氨酸、二硫苏糖醇或
其他含有一SH键等自由基清除剂,降低这些氧化性的自由基对样品
造成的影响。

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